增强LNP-mRNA的效力和安全性 - II
本文节选自来自BioNTech的研究人员Irena Vlatkovic发表的文章《Non-Immunotherapy Application of LNP-mRNA: Maximizing Efficacy and Safety》，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“增强LNP-mRNA应用的效力和安全性 - I”。
LNP-mRNA候选药物中mRNA和LNP成分的创新及其生产方法的改进是这一相对年轻的治疗领域的标志。这种不断的发展是LNP-mRNA的巨大治疗潜力和预期增长的基础，不仅针对疫苗和免疫治疗，而且也针对更具挑战性的应用，如RNA蛋白替代和单克隆抗体治疗。mRNA水平的创新包括(1)RNA核苷修饰、(2)序列和结构优化、(3)IVT mRNA的生产和纯化方法(图3)。
图3. 提高LNP-mRNA的有效性和安全性的策略。(a) mRNA优化包括(1)使用不同的mRNA核苷修饰；(2)通过改变帽结构和/或利用抗反向帽类似物(ARCA)增加mRNA的加帽；(3)选择最有效的UTR：通过避免或利用微(mi)RNA、长非编码(lnc)RNA和RNA结合蛋白(RBP)识别的调控基序，优化5’和3’ UTR；(4)通过使用更频繁的密码子，避免特定的基序，改变G:C含量，优化编码序列(CDS)；(5)通过改变体外转录(IVT)反应的成分和条件来减少副产物，提高产量，并开发适合不同应用的最佳纯化方案。(b)脂质纳米颗粒(LNP)优化可能包括(1)改变LNP组分之间的化学性质和摩尔比，重点关注可电离脂质和隐形脂质的生物可降解性和新颖性；(2)主动靶向其它组织，如使用可识别T细胞、淋巴细胞和脑或肺血管上的特定分子的单克隆抗体（mAb）。(c)此外，为了获得更高的疗效和最大的安全性，可能可以使用与LNP-mRNA候选药物共制剂的分子，如糖皮质激素(地塞米松)或其它已知可抑制先天免疫的小分子。优化作为组分的mRNA和LNP，并将LNP-mRNA与免疫抑制剂结合，旨在提高LNP-mRNA候选药物的安全性和有效性。
IVT mRNA生产和纯化方法
IVT mRNA的整个生产过程是一个不断创新和优化的领域，目的是尽可能降低dsRNA和其它污染物的水平，从而实现mRNA疗法的低免疫原性。例如，Wu等人利用高温和热稳定性T7RNA聚合酶生产免疫原性降低的mRNA，而不需要纯化。然而，为了获得最大纯度的单链mRNA，各种纯化方法被广泛使用。例如，离子对反相高效液相色谱法(HPLC)仍然被认为是从mRNA中去除不需要的副产物/污染物的金标准方法。遗憾的是，HPLC很难大规模生产大量的mRNA，并会导致大量的有害废物的产生。因此，最近开发了纤维素层析法。该方法在去除dsRNA污染物和生产高纯度、低免疫激活可能性的mRNA方面表现出了极大的效率。
LNP优化
除了优化mRNA及其生产，LNP的优化也具有极大的潜力，可以显著提高基于LNP-mRNA的治疗药物的安全性和有效性。该领域可以区分的具体主题有：(1)针对不同应用路径的可电离脂质和可生物降解脂质的创新；(2) LNP-mRNA组成优化；(3)创新隐形脂质；(4)通过基于LNP的改变实现特定的细胞/器官靶向(图3b)。在本文中，将对这些议题进行概括性介绍。
可电离氨基脂质是影响LNP-mRNA药物效力和耐受性的主要LNP成分。它们在细胞摄取、核内体逃逸和LNP非特异性结合血清蛋白到LNP表面的能力中发挥作用。第一个获临床批准的氨基脂质是MC3(DLin-MC3-DMA)。然而，已知这种脂质在机体中有较长的半衰期，在临床研究中会导致轻到中度的不良反应，因此不适合重复给药应用。因此，新型可电离和完全可生物降解的脂质不断被开发出来。例如，Maier等人以MC3为基础，开发了一组新的可生物降解脂质，其中L319能够快速从血浆和组织中清除。此外，根据血清化学和组织病理学，在临床前背景中，L319单次注射剂量达10 mg/kg时耐受性良好。Sabnis等人利用合理的药物化学方法优化了氨基脂质，发现了一种名为LNP5的结构，在小鼠和猕猴中显示出良好的药代动力学、表达特性、核内体逃逸效率、组织清除率和耐受性。虽然这两项研究都侧重于静脉给药(i.v)，但Hasset等人侧重于优化LNP的肌注应用(i.m)，并筛选了30种新型可电离可生物降解的脂质。作者在免疫原性和表达的初步筛选中检测到了与应用路径相关的差异。在小鼠、大鼠和NHP中，5种新型脂质可导致LNP-mRNA的最高表达且免疫原性较低。
LNP-mRNA组成的优化包括改变脂质比例或脂质-mRNA比例。为了优化将mRNA递送到肝脏的LNP，Kaufmann等人开发了一种实验设计(DOE)方法。相比基于针对LNP-siRNA递送的LNP配方的对照LNP-mRNA，通过提高可电离脂质:mRNA的重量比，并加入1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)作为辅助脂质，作者显著提高了载促红细胞生成素mRNA的LNP的效率。Sago等人通过改变氨基脂质化合物、摩尔量、PEG的结构以及胆固醇的摩尔量，配制了多个LNP文库(总数>250LNP)。作者将Cre mRNA和DNA代码制剂至每种LNP，并将其静脉或肌肉注射到Lox-Stop-Lox-tdTomato (Ai14)小鼠。他们基于Cre mRNA翻译为Cre蛋白以及目标DNA被Cre蛋白编辑的荧光细胞的分离，测试了LNP文库的体内递送。这种方法帮助鉴定了两种新型LNP，其可以有效地向内皮细胞递送mRNA。本研究表明，优化LNP组成不仅对提高LNP的效力很重要，而且可以作为鉴定具有新的趋向性的LNP的途径。
像PEG-脂质这样的隐形脂质对于增加LNP颗粒的半衰期和稳定性以及影响其理化性质是必要的。LNP-mRNA进入血液后，LNP在其表面吸附大量蛋白质形成“蛋白冠”。这些蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、载脂蛋白、凝血因子和补体蛋白。PEG-脂质屏蔽可降低LNP与补体等蛋白的相互作用，从而降低巨噬细胞对LNP-mRNA的内化，增加LNP-mRNA在血液中的循环时间。此外，PEG-脂质屏蔽对可能由蛋白冠引起的过滤器官中不希望发生的聚集和累积也有影响。然而，PEG屏蔽也可能降低载脂蛋白E (ApoE)的识别，并导致抗-PEGADA的形成，从而降低LNP的效率。因此，必须优化PEG屏蔽的水平，以获得有效性和安全性之间的折衷。关于抗-PEGADA的形成，Suzuki等人最近的一项研究检测了小鼠中含有PEG的LNP-siRNA，发现与长酰基链LNP相比，具有快速脱落PEG脂质(短酰基链)的LNP诱导的抗PEG IgM更少。与Kupffer细胞(肝巨噬细胞)相比，使用快速脱落PEG-脂质可以更有效地靶向肝细胞，从而提高LNP-siRNA药物的有效性。本研究与之前Judge等的研究一致，作者发现，相比使用更长烷基链C16PEG-脂质，使用含更短烷基链（C14）PEG-脂质的PEG修饰脂质体时，给小鼠重复给药，形成的抗-PEG抗体更低，且可显著降低副作用。直接检测抗PEG抗体对含PEG脂质的LNP-mRNA药物疗效和安全性影响的研究仍然非常有限。最近，Nogueira等人检测了不同链长和摩尔分数的隐性脂质聚肌氨酸(PSar)，并发现与含PEG的LNP相比，其mRNA递送效率良好，且细胞因子促炎特性较低，并可降低补体激活和肝毒性标志物。
针对特定组织的定位和LNP-mRNA治疗药物对特定细胞类型和器官的主动靶向是一个特别有趣的话题，可以改善当前的脱靶效应，并为难以靶向的组织的新应用铺平道路。如前所述，通过在3’UTR中引入细胞类型特异性miRNA目标位点而在mRNA水平上进行优化，以实现特定组织的定位，前者可使mRNA降解，导致LNP-mRNA在选定细胞类型中的翻译效率丧失。然而，LNP水平上的优化是目前研究的重点，通过改变LNP的结构成分，优化LNP的组成，或利用功能化表面主动靶向特定细胞，如靶向配体或抗体。目前大多数开发的LNP主要通过载脂蛋白E (ApoE)介导的摄取定位到肝脏。ApoE在循环中与LNP结合，促进与肝细胞上的低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，使LNP- mRNA内吞噬到细胞中。因此，目前大多数临床前和临床RNA蛋白替代以及罕见疾病研究都考虑肝脏疾病或利用肝脏作为蛋白质生产工厂，即使用会自然累积在肝细胞中的直径小于100nm的经典LNP制剂。>100 nm的LNP颗粒可能是肝细胞靶向的一个限制因素，特别是在人体中，这可以从Wisse等人的研究中推断出来，他们检测了窗孔（fenestrae）的大小。窗孔是无肝脏病理的人肝窦中大小为107 ±1.5 nm的小孔，而啮齿动物的大小明显更大：C57BL/6小鼠(141±5.4nm)和Sprague-Dawley大鼠(161±2.7nm)。为了到达肝细胞，LNP-mRNA必须通过窗孔，因此，为了靶向肝细胞，LNP-mRNA的大小限制在100 nm左右。
LNP在其它器官的定位通常需要LNP的优化或主动靶向。在Sago等人进行的筛选中，LNP组分优化是重要的一部分，其发现7C2和7C3 LNP能够有效靶向内皮细胞。Gan等人使用与Sago等人相同的筛选方法，测试了包含109个LNP的库，这些LNP由含有金刚烷烃链的“约束性磷脂”组成。该研究发现了一种新型LNP，其可在没有靶向配体的情况下向Kupffer细胞而不是肝细胞递送mRNA。最近，Zukancic等人使用Onpattro® LNP，将1,2-二硬脂-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇)(PEG-DSPE)替换为含短(C11) PEG烷基链的Tween20。作者发现短PEG烷基链的使用在小鼠肌肉注射后可显著提高淋巴结的靶向性。很少有研究关注淋巴细胞的主动靶向。Ramishetti等人通过抗-CD4单克隆抗体使LNP表面功能化以靶向CD4+ T细胞。Veiga等人使用了ASSET (锚定二级scFv 赋能靶向)，其中抗Ly6c mAb与LNP连接，以靶向Ly6c+炎症白细胞。作者在炎症性肠病的葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎小鼠模型中，应用抗ly6c单抗包被或同型对照LNP-配方IL-10 mRNA，测试了这种策略，结果显示了LNP-mRNA靶向 vs. 非靶向方法的有益效果。最近，Ramishetti等人合成了一组新型离子化脂质，并将其用于mRNA的制剂，筛选了LNP-mRNA在白细胞中的表达和安全性，并利用β7整合素主动靶向原代淋巴细胞。为了主动靶向炎症脑组织，Marcos-Contreras等将抗血管细胞粘附分子1 (VCAM) mAb标记到LNP制剂的血栓调节蛋白mRNA上。VCAM在脑血管内皮高表达且VCAM靶向的LNP-血栓调节蛋白mRNA在TNFα损伤脑小鼠模型中累积，并降低了TNFα注射引起的脑水肿。同样，抗血管细胞粘附分子，PECAM-1 mAb，用于靶向肺部LNP-mRNA，与非靶向组织相比，可增加约200倍的递送。
如果在对mRNA和LNP进行优化后，LNP-mRNA的不良免疫刺激特性成分仍然存在，那么另一种抑制和降低其潜在不良影响的可能性是将强效皮质类固醇直接加入LNP-mRNA药物产品中(图3c)。Chen等人将一种有效的皮质类固醇地塞米松加入到含有多种核酸的LNP中。他们使用生物可降解的连接剂将亲脂酰基/烷基部分与地塞米松进行化学结合，合成了地塞米松前药，其可有效地并入LNP中。使用包含10 mol %地塞米松的LNP-mRNA具有较强的免疫刺激改善，以3mg/kg mRNA的剂量进行小鼠静脉注射4h后，可显著降低血浆中的IL - 6、TNFα、IL12p70、IL-1β、IL-10和角质形成细胞趋化剂(KC) /人生长调节致癌基因(GRO) (KC/ GRO)。有趣的是，与LNP-mRNA治疗药物联合给药的游离地塞米松相比，并入的地塞米松的免疫抑制作用显著提高。防止LNP-mRNA潜在有害免疫刺激的其它策略包括使用其它小分子或针对关键先天免疫反应介导因子的siRNA。然而，这种先天免疫抑制剂的有效性仅在罕见的特定病例中得到证实，这表明其潜在的挑战在于更广泛的适用性和进一步研究的必要性。
原文：I.Vlatkovic,Non-Immunotherapy Application of LNP-mRNA: Maximizing Efficacy and Safety.Biomedicines, 2021, https://doi.org/10.3390/biomedicines9050530.
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